Отделяне на митохондрии чрез високоскоростна охлаждаща центрофуга himac CR22N, производство на Hitachi Koki (Япония)
Митохондриите са вътреклетъчни органели в повечето еукариотни клетки, притежаващи собствена ДНК. Митохондриите са енергийните централи на клетката. Метод на диференцирано центрофугиране за изследване на субклетъчни структури, в частност митохондрии е разработен от доктор Албер Клод, удостоен с Нобелова награда за фитология и медицина през 1974 година.
В дадения експеримент се разглежда отделянето на митохондрии от чернодробни клетки на мишки по метода на центрофугиране. В процеса на отделяне са използвани нови чаши с уникална форма, летящ ротор R8S, който може да се използва за високоскоростно центрофугиране с охлаждане при ускорение 11 500 g и конусни епруветки с обем 50 мл.
Описание на експеримента
10% хомогенат от черен дроб на мишка (количество на тъканите: от 10 до 20 г)
Центрофугирането се провежда при скорост 1 800 об./мин., ускорение 600 g, в продължение на 10 минути, при +4°С, с режим на ускорение/спиране – 9/9
Изсипете повърхностния слой в 50 мл конусна епруветка
Центрофугирането се провежда при скорост 5 600 об./мин., ускорение 5500 g, в продължение на 20 минути, при +4°С, режими на ускорение/спиране – 9/9
Дренирайте повърхностния слой, като при преливането леко разклатете епруветката няколко пъти, за да отделите червено-кафявата липозомна фракция в горната част на утайката. Добавете необходимото количество 0.25-молярен разтвор на захароза в останалата жълто-кафява утайка от митохондрии и отново центрофугируйте при скорост 5 800 об./мин., ускорение 6000 g, в продължение на 15 минути, при +4° и режими на ускорение/спиране – 9/9
Оборудване
- Центрофуга: високоскоростна центрофуга с охлаждане CR22N
- Ротор: летящ ротор R8S (за 4 епруветки)
- Епруветки: 50 мл епруветки с конусно дъно
Утайка: фракция митохондри
Количеството на митохондриите, получени по описаната по-горе методика е еквивалентен на белтъчно съдържание от 15 до 30 мг на грам миши черен дроб.
Забележка: Колкото повече пъти се повтаря гореописаната операция, толкова по-висока е чистотата на отделените митохондрии, обаче при повторенията се понижава активността, поради което се препоръчва повторение на гореописаната операция само два пъти.
