Отделяне на РНК от растителна тъкан с използване на настолни високоскоростни микроцентрофуги himac CT15E/CT15RE, производство на Hitachi Koki (Япония)
В този експеримент се разглежда получаването на висококачествена РНК от растителна тъкан с използване на комплекта RNeasy Plant Mini Kit (QIAGEN) на микроцентрофуги himac CT15E или CT15RE при използване на ъглови ротори T15A61/T15A62. Методът за отделяне на РНК със няколко стадия на центрофугиране е прост и ефективен метод за получаване на чисти проби.
Описание на експеримента
С помощта на течен азота смелете растителната тъкан на ситен прах чрез счукване в хаванче
Сипете праха в 2 мл микроепруветка
Добавете 450 мкл буфер RLT в епруветката и разклатете енергично
Инкубирайте при температура +56 °С в продължение на 1-3 минути
Поставете QIAshredder спин колонка в нова 2 мл микроепруветка. Излейте лизата в QIAshredder спин колонката. При изливането на лизата в спин колонката, внимавайте да не капят клетъчни остатъци. Отрежете капачето на микроепруветката, съдържаща спин колонката
Центрофугируйте при 15 000 оборота в минути (21 500 g) в продължение на 2 минути при стайна температура
Налейте филтрата в нова 2 мл микроепруветка
Добавете 0,5 обем (или повече ) 96% или повече концентриран етанол в епруветката и разбъркайте внимателно с пипета
Поставете RNeasy спин колонката в нова 2 мл микроепруветка. Налейте 650 мкл от смесения разтвор в RNeasy спин колонката. Отрежете капачето на микроепруветката, съдържаща спин колонката
Центрофугируйте при 9 200 об./мин. (8 000 g) в продължение на 15 секунди при стайна температура
Отстранете филтрата
Добавете 700 мкл буфер RW1 в RNeasy спин колонката
Центрофугируйте при 9 200 об./мин. (8 000 g) в продължение на 15 секунди при стайна температура
Отстранете филтрата
Добавете 500 мкл буфер RPE в RNeasy спин колонката
Центрофугируйте при 9 200 об./мин. (8 000 g) в продължение на 15 секунди при стайна температура
Отстранете филтрата
Добавете 500 мкл буфер RPE в RNeasy спин колонката
Центрофугируйте при 9 200 об./мин. (8 000 g) в продължение на 2 минути при стайна температура
Поставете RNeasy спин колонката, използвана в гореописаната процедура, в нова 1,5 мл микроепруветка
Добавете 30-50 мкл дестилирана вода в RNeasy спин колонката
Центрофугируйте при 9 200 об./мин. (8 000 g) в продължение на 1 минута при стайна температура
Извадете RNeasy спин колонката от епруветката. Елуент разтвора на РНК в епруветката трябва да се съхранява при 70°С.
Оборудване
- Центрофуга: настолна високоскоростна микроцентрофуга CT15E или CT15RE
- Ротор: ъглов ротор T15A61 (2мл/1.5мл х 24 епруветки) или T15A62 ъглов ротор
- Комплект за отделяне: RNeasy Mini Kit (QIAGEN)
Забележка:
- Обезателно прочетете инструкцията за експлоатация на ротора преди използване.
- Прочетете инструкцията за експлоатация на комплекта QIAGEN за детайлизация на протокола.
- Не задавайте скорост ротора по-висока от 10 000 об./мин. (12 000 g) при използване на 1,5 мл микроепруветки с отворена капачка при +4 °С. Капачката може да се откъсне под действието на центробежната сила