Отделяне на грипен вирус с помощта на настолна ултрацентрофуга himac CS150NX, производство на Hitachi Koki (Япония)
Вирусът на грипа се отнася към семейството на ортомиксовирусите и съдържа моноверижни молекули РНК. Съществуват 3 вида вируси на грипа в зависимост от серотипа – А, В и С. Вирусът на грипа има сферична форма и диаметър 80-120 нм. Отделянето и изследването на различните вируси на грипа има огромно практическо значение във връзка с пандемиите в последните години.
В дадения експеримент се извършва отделяне на грипни вируси с помощта на ъглов ротор S50A на настолна ултрацентрофуга himac CS150NX, която притежава най-добри характеристики на скоростта и ускорението в своя клас.
Описание на експеримента
Центрофугиране на заразена алантоична течност или заразена клетъчна култура се извършва при скорост 6 000 об./мин. в продължение на 20 минути за отделяне на грубата фракции (остатъците)
Прехвърлете повърхностния слой в дебелостенни поликарбонатни епруветки от 25 мл (по 19 мл в епруветка)
Центрофугирането се извършва на ъглов ротор S50A при скорост 32 000 об./мин., в продължение на 45 минути, при +4°С и режими на ускорение/спиране – 9/7
Отстранете повърхностния слой и добавете 1,5 мл вероналов буфер, включително 3 мМ CaCl<sub>2</sub>, до сгъстяване на утайката. (За предотвратяване на вирусно струпване, добавете не голямо количество буфер към утайката. Оставете го за през нощта при +4°С и го пипетирайте.)
Концентрираната вирусосъдържаща течност се наслоява върху градиентния разтвор захароза (по 17 мл 10-40%), в предварително приготвени в дебелостенни поликарбонатни епруветки от 25 мл
Центрофугиранто се извършва на ъглов ротор S50A при 32 000 об./мин. в продължение на 45 минути, при +4°С и режими ускорение/спиране – 9/7
В горната част на епруветката се формира бял вирусен слой, който може лесно да се види като се разгледа епруветката срещу светлина. Съберете вирусния слой (примерно 2 мл)
Разредете вирусната фракция с буфер, примерно 1,5 пъти (доведете до обем 3 мл). Полученият разтвор се наслоява върху градиентен разтвор на захароза (по 15 мл 30-60%) в дебелостенна поликарбонатна епруветка от 25 мл
Центрофугирането се извършва на ъглов ротор S50A при 32 000 об./мин. в продължение на 3 часа при +4°С и режими на ускорение/спиране – 5/7
Съберете образувалия се вирусен слой и го разредете с буфер 2,5 пъти или повече
Центрофугирането се извършва на ъглов ротор S50A при 32 000 об./мин. в продължение на 1 час при +4°С и режими на ускорение/спиране – 9/7
Добавете буфер към утайката и суспендирайте.
Оборудване
- Центрофуга: настолна ултрацентрофуга himac CS150NX
- Ротор: ъглов ротор S50A (може да работи с 6 епруветки едновременно)
- Епруветки: поликарбонатни дебелостенни епруветки по 25 мл
