Отделяне на геномна ДНК от растителна тъкан с използване на настолна високоскоростна микроцентрофуга himac CT15E/CT15RE, производство на Hitachi Koki (Япония)
В този експеримент се разглежда получаването на геномна ДНК от растителна тъкан с използване на комплект DNeasy Plant Kit (QIAGEN) на микроцентрофуга himac CT15E или CT15RE, при използване на ъглови ротори T15A61/T15A62. Отделянето на геномна ДНК с помощта на центрофугиране има ред предимства пред другите методи.
В този експеримент се разглежда получаването на геномна ДНК от растителна тъкан с използване на комплект DNeasy Plant Kit (QIAGEN) на микроцентрофуга himac CT15E или CT15RE, при използване на ъглови ротори T15A61/T15A62. Отделянето на геномна ДНК с помощта на центрофугиране има ред предимства пред другите методи.
Оборудване
Центрофуга: настолна високоскоростна микроцентрофуга CT15E или CT15RE
Ротор: ъглов ротор T15A61 (2мл/1.5мл х 24 епруветки) или T15A62 ъглов ротор
Комплект за отделяне: DNeasy Plant Mini Kit (QIAGEN)
Описание на експеримента
С помощта на течен азота смелете растителна тъкан до ситен прах чрез счуване в хаванче
↓
Сипете праха в 2 мл микроепруветка
↓
Добавете 400 мкл буфер AP1 и 4 мкл RNease A в концентрация 100 мг/мл в епруветка и разклатете енергично
↓
Инкубация при температура +65 °С в продължение на 10 минути. Разбъркайте 2-3 пъти по време на инкубацията
↓
Добавете 130 мкл буфер AP2 в епруветка и разбъркайте
↓
Инкубирайте върху лед в продължение на 5 минути
↓
Центрофугируйте при 14 500 об./мин. (20 000 g) в продължение на 5 минути при стайна температура
↓
Поставете QIAshredder Mini спин колонка в нова 2 мл микроепруветка. Изсипете повърхностния слой в QIAshredder мини спин колонка. Отрежете капачката на микроепруветката, съдържаща спин колонката
↓
Центрофугируйте при 14 500 об./мин. (20 000 g) в продължение на 2 минути при стайна температура
↓
Налейте фракция от филтрата, пропускайки го през колонката, в нови 2 мл микроепруветка
↓
Добавете 1,5 обем (или повече) буфер AP3/E повече в епруветката и внимателно разбъркайте с пипета
↓
Поставете DNeasy Mini спин колонка в нова 2 мл микроепруветка. Налейте 650 мкл от смесения разтвор в DNeasy Mini спин колонка. Отрежете капачката на микроепруветката, съдържаща спин колонката
↓
Центрофугируйте при 8 000 об./мин. (6 000 g) в продължение на 1 минута при стайна температура
↓
Отстранете филтрата
↓
Добавете 500 мкл буфер AW в DNeasy Mini спин колонка
↓
Центрофугируйте при 8 000 об./мин. (6 000 g) в продължение на 1 минута при стайна температура
↓
Отстранете филтрата
↓
Добавете 500 мкл буфер AW в DNeasy Mini спин колонка
↓
Центрофугируйте при 14 500 об./мин. (20 000 g) в продължение на 2 минути при стайна температура и изсушете филтъра
↓
Поставете DNeasy Mini спин колонката след описаната по-горе процедура в нова 1,5 мл микроепруветка и добавете буфер AE в колонката
↓
Задръжте при стайна температура в продължение на 5 минути
↓
Центрофугируйте при 8 000 об./мин. (6 000 g) в продължение на 1 минута при стайна температура
↓
Извадете DNeasy Mini спин колонката от епруветката. Елуент разтвора на геномна ДНК в епруветката трябва да се съхранява при -70 °С.
Забележка:
1. Обезателно прочетете инструкцията за експлоатация на ротора преди използване.
2. Прочетете инструкцията за експлоатация на комплекта QIAGEN за детайлизация на протокола.
3. Не задавайте скорост на ротора по-висока от 10 000 об./мин. (12 000 g) при използване на 1,5 мл микроепруветки с отворена капачка при +4 °С. Капачката може да се откъсне под действието на центробежната сила.
